20bp DNA ladder

● 產(chǎn)品編號(hào)及規(guī)格：

RTM441          50次 (250 μl)    

● 產(chǎn)品組成：

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本產(chǎn)品是由13條帶狀雙鏈DNA條帶組成的精準(zhǔn)定量Marker，適用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中DNA條帶大小和含量的分析。13條帶的大小分別為20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，300，400，500 bp。其中100bp和200bp條帶為加亮帶，含量為100ng/5μl，其余條帶濃度為50ng/5μl。

本產(chǎn)品為雙鏈DNA Marker，適用于非變性的PAGE電泳和瓊脂糖凝膠電泳，不適用于尿素PAGE電泳。由于片段較小，如使用瓊脂糖分離，建議使用高分辨率瓊脂糖凝膠電泳分離。

按照每次上樣5 μl計(jì)算，該產(chǎn)品可以使用50次。

● 儲(chǔ)存條件：

 -20℃ 貯存,有效期3年。

● 使用方法：

一、 TBE-PAGE凝膠分離：

1、制備凝膠步驟：

1.1參照凝膠模具說(shuō)明書，裝配好凝膠模具。

1.2按照表一將不同體積的成分在小燒杯或試管中混合；最后加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。

   注：20bp DNA ladder 適用于配制20%TBE-PAGE膠。

1.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對(duì)于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-2 cm的無(wú)水乙醇，使凝膠表面保持平整。

1.4靜置10-20分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面后，說(shuō)明凝膠已聚合

表一 TBE-PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于1mm厚度小板膠)

1.5去除覆蓋在分離膠上的乙醇；按照表二將不同體積成分在一個(gè)小燒杯或試管中混合；最后加入10%過(guò)硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。

表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml，適用于1mm厚度小板膠)

1.6將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端；將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。

1.7靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。

注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。可以根據(jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。

2、電泳：

2.1 將凝膠板固定在電泳裝置上，往上槽和下槽中加入1×TBE電泳液，1 ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。

2.2 取待測(cè)樣品，加入相應(yīng)體積6×Native PAGE DNA上樣緩沖液，如5 μl樣品加1 μl 上樣緩沖液，短暫離心后取5-10 μl上樣。 20bp DNA ladder  1 mm厚10齒梳子上樣5 μl，其余梳齒和厚度凝膠適量調(diào)整上樣量。

2.3 連接電源線，打開電源開關(guān)。200V穩(wěn)壓電泳。至二甲苯菁指示前沿到達(dá)凝膠三分之二位置時(shí)結(jié)束電泳（此時(shí)溴酚藍(lán)指示前沿已經(jīng)跑出凝膠，不可見）。

3、染色：

3.1 漂洗：玻璃板上拆下凝膠后，適量蒸餾水漂洗3-5分鐘。

3.2 染色液配制：

  TBE-PAGE膠可以使用EB或RealSafe類染料后染染色，以下程序用RealSafe Red核酸染料（貨號(hào)：GR002）進(jìn)行染色。即用型染色液配制：

3.3染色和觀察：

  凝膠浸泡于即用型染色液中，常溫避光搖床40-60 rpm染色30 分鐘。紫外光下觀察。

二、 瓊脂糖凝膠分離：

1. 瓊脂糖凝膠制備：

  由于片段較小，建議選用高分辨率瓊脂糖（貨號(hào)AR1036）制膠。

以下步驟以制備50 ml 3%凝膠為例：

稱取1.5 g瓊脂糖于玻璃三角瓶中，加入50 ml 1×TAE，5 μl RealSafe Red核酸染料或其他核酸染料（如EB，GoldView），混勻，蓋好瓶蓋，微波爐中火加熱至沸騰，輕搖混勻，重復(fù)1-2次至瓊脂糖完全溶解，無(wú)可見顆粒。倒入制膠容器中，插好梳子，常溫凝固30-50分鐘至凝膠完全凝固。

2. 電泳：

取待測(cè)樣品，加入相應(yīng)體積6×DualColor DNA loading buffer，如10 μl樣品加2 μl 上樣緩沖液，短暫離心后取5-10 μl上樣。 20bp DNA ladder  1 mm厚10齒梳子上樣5 μl，其余梳齒和厚度凝膠適量調(diào)整上樣量。

建議電泳條件：凝膠濃度為3％，電泳電壓8-10 v/cm（單位電壓指電泳槽陰陽(yáng)極之間的距離電壓，如陰極陽(yáng)極之間的距離為20 cm，可以用160-200 V電壓進(jìn)行穩(wěn)壓電泳），待溴酚藍(lán)指示前沿距離凝膠末端2 cm時(shí)終止電泳，電泳時(shí)間35-40分鐘。

注：3% 瓊脂糖TAE電泳中，溴酚藍(lán)大小約為20bp，二甲苯菁大小約200bp。

3. 紫外燈下觀察條帶。

注：使用EB或Goldview染料時(shí)，由于染料本身帶正電荷較多，隨著電泳時(shí)間的延長(zhǎng)，染料會(huì)向陰極聚集，導(dǎo)致小片段核酸結(jié)合的染料含量降低，會(huì)出現(xiàn)小片段的DNA片段紫外燈下亮度變?nèi)趸虿豢梢?。此時(shí)可以將膠浸泡于含有染料的1×TAE緩沖液中染色15-20分鐘即可看到小片段。

4. 實(shí)驗(yàn)示例：

使用RTM441 20bp DNA ladder產(chǎn)品發(fā)表部分文章列表：

1. [2022 IF=6] A novel fuorescent sensor based on aptamer recognition and DNA walker amplication strategy and its determination of 17b-estradiol.

Author: Yajun Zhang, Licong Jia, Wei Wang, Meng Jiang, Hongying Zhang, LingMei Niu

Marker: RTM441，20bp DNA ladder

Journal: Arabian Journal of Chemistry. 16 (2023) 105340.

Institution：School of Public Health, Hebei Medical University

Paper link：https://doi.org/10.1016/j.arabjc.2023.105340